Vero细胞无血清悬浮培养技术验证实验

  大多数用于抗体生产的细胞主要基于动物细胞上的开发，如 MRC-5 人二倍体细胞、 Vero 猿猴肾上皮细胞、Madin-Darby 犬肾 (MDCK) 细胞和鸡胚成纤维细胞 。尤其是来自非洲绿猴肾脏的 Vero 细胞已被广泛用于vaccine生产，因为它们被WHO机构证明没有致癌潜力。许多vaccine，例如针对基孔肯雅热、登革热、日本脑炎、病毒性胃肠炎、脊髓灰质炎、狂犬病、罗斯河热、严重急性呼吸系统综合症、天花、西尼罗河脑炎和流感的 vaccine都是使用 Vero 细胞培养系统开发的。

用于virus  vaccine生产的细胞依赖于贴壁，因此涉及这些细胞的过程不能轻易扩大规模，因为需要贴壁空间和胰蛋白酶消化。这导致了具有悬浮生长能力的永生和稳定细胞系的发展.近期研究中，研究人员成功地在微载体上培养了 Vero 细胞，用于制备这些细胞的悬浮培养物。实验表明，在没有微载体的情况下培养的悬浮适应性 Vero 细胞比贴壁 Vero 细胞产生更高量的 virus。

Vero 细胞培养使用动物来源的成分较多，如血清、胰蛋白酶、乳清蛋白等。由于成本高和批次间差异，尽量使用血清。此外，牛血清的病毒、细菌和真菌、支原体污染也是细胞培养中的主要污染来源。因此，无血清细胞培养体系的优化对于疫苗株的生产是必要的。  之前的研究中，在无血清 EX-Cell MDCK 中培养的 MDCK 细胞比在含血清的 Glasgow 低必需培养基中培养的细胞产生更多的 virus。此外，还探索了在无血清培养基中培养 Vero 细胞来生产许多virus  vaccine。

在这项研究中，我们试图促进 Vero 细胞在振荡悬浮培养系统中的适应性，并确定哪种培养基最适合在无血清的情况下培养 Vero 细胞。与传统的 Vero 细胞贴壁培养相比，Vero 细胞成功地适应了悬浮培养系统并产生了更多的 Adv。

实验前准备：

Vero 和 FRhk-4 细胞使用 10% 胎牛血清的DMEM培养基，培养基中添加1u/mL的青霉素和 1 µg/mL 链霉素。培养条件为 5% CO₂含量，37℃。

MRC-5 细胞在含有 10% FBS 和 1 U/mL 青霉素和 1 µg/mL 链霉素的改良型 Eagle 培养基中。培养条件为 5% CO 2中， 37℃培养。

5 型 Adv (Ad5)  - GFP绿色荧光蛋白 。使用含有 2% FBS 的 DMEM 在 Vero 细胞中进行转染繁殖。

一、培养基的选择性实验

OptiPRO SFM 和 VP-SFM 是无血清、超低蛋白培养基，不含蛋白质、肽或其他动物或人类来源的成分。

Gibco 的Opt-MEM 减血清培养基是一种改进的 MEM，可以减少 FBS 的添加量。UltraCULTURE 培养基是一种无血清培养基，设计用于培养补充有重组人胰岛素、牛转铁蛋白和牛血清蛋白（包括白蛋白）的纯化混合物的哺乳动物细胞类型。

SFM4MegaVir属于一种无蛋白培养基，使用这种培养基的目的在于提高不含动物来源成分的virus  vaccine生 产过程的产量。实验过程中需要 逐步降低 FBS 的百分比值，来适应无血清培养条件。

我们主要在Optipro、UltraCULTURE、SFM4MegaVir、OptiMEM 和 VP-SFM这五种培养基中尝试了细胞适应。

1.细胞在 5% CO2 下培养2条件37℃。将细胞以1×10 ⁶ 个细胞/培养皿的浓度接种在细胞培养皿中。

2.在 37℃、5% CO 2条件下培养 72 小时后，使用细胞计数仪和 0.4% 台盼蓝染色测定总细胞数，然后用 1×10 ⁶ 个细胞/盘，逐步减少常规培养基的百分比。

3.使用放大 100 倍的倒置相差显微镜根据细胞数量和形状评估在培养基中培养的细胞的形态。

二、Vero 细胞悬浮培养

1.Vero 细胞在 250 mL 锥形瓶中在 5% CO 2条件置于二氧化碳振荡培养箱中进行培养。贴壁细胞置于锥形瓶中，CO2摇床中，5% CO 2条件下，37℃培养5天；

2.使用血细胞计数器以及 0.4% 台盼蓝染色评估活细胞。

3.接下来，将粘附细胞以1.6×10 ⁵ 个细胞/m的密度添加到振荡悬浮培养物中。连续培养悬浮培养中的活细胞，并通过台盼蓝染色监测其活力180天。

三、细胞转染

Ad5  Adv包含在巨细胞病毒启动子控制下的 GFP 基因。用Vero细胞进行Adv繁殖，然后用TCID 50滴定。为了比较粘附培养系统和悬浮培养系统之间的Adv产量，将两种类型的 Vero 细胞接种（以 1.3×10 ⁶ 个细胞/mL 的密度）在培养皿或锥形瓶中并孵育 5 小时。然后以0.1的感染复数感染细胞5天。通过使用荧光酶标仪测量荧光强度来确定产生的 Ad5-GFP 的相对量并使用 GraphPad Prism ver.软件进行统计分析。

四、统计分析

数据表示为平均值±平均值的标准误差。使用 GraphPad Prism ver. 进行统计分析。所有 p 值均使用未配对的双尾学生 t 检验 (α=0.05) 在 p<0.001 的显着性水平上进行评估。

五、Vero细胞无血清悬浮培养技术验证

为了研究Vero细胞是否可以在无血清条件下培养，对Vero细胞的形态变化和生长速率进行了VP-SFM、Ultraculture、OptiPRO-SFM、Opti-MEM和SFM4MegaVir测试。在低血清培养条件下，在 OptiPRO、SFM4MegaVir 或 VP-SFM 中培养的 Vero 细胞表现出与在常规培养基（含 10% FBS 的 DMEM）中培养的 Vero 细胞相似的形态（图 1A ）). 然而，在 Ultraculture 或 Opti-MEM 中培养的 Vero 细胞表现出异常形态，例如细胞聚集，这在常规培养条件下是观察不到的。当血清浓度从 10% 降低到 0% 时，OptiPRO 培养的 Vero 细胞在 0% FBS 的初始培养阶段生长速率降低，但与常规培养条件（DMEM）相比，它们的生长速率增加并更高在 0% FBS 中培养 51 天后，含 10% FBS）（图 1B）。然而，在 VP-SFM 或 SFM4MegaVir 培养基中培养的 Vero 细胞的生长速率低于在常规培养条件下培养的 Vero 细胞。总的来说，使用 OptiPRO 无血清培养基培养 Vero 细胞时不会发生形态变化和生长速率下降。

图 1

(A) 在无血清条件下生长的 Vero 细胞形态。蓝色和红色箭头代表异常的细胞生长。(B) 与在含有 10% FBS 的 DMEM 中培养的细胞（对照；蓝线）相比，在无血清条件下培养的细胞的生长速率。DMEM，Dulbecco 改良的 Eagles 培养基；FBS，胎牛血清。

对照组实验

我们测试了 Vero 细胞的无血清条件是否可以应用于另一种疫苗株生产细胞系 MRC-5 和对照细胞，即 FRhk-4 细胞。与在常规培养基（含有 10% FBS 的 MEM）中培养的细胞相比，在 SFM4MegaVir Opti-Pro 或 VP-SFM 中培养的所有 MRC-5 细胞均显示出异常的细胞形态，例如细胞缩短（图 2A ）。在 Opti-MEM、SFM4MegaVir、Opti-Pro、VP-SFM 或 Ultraculture 中培养的 FRhk-4 细胞未显示任何异常形态（图 2C）). MRC-5 细胞在 VP-SFM 或 OptiPRO 无血清培养基中的生长速率低于在常规培养基（含 10% FBS 的 MEM）中培养的细胞，但在 Opti-MEM 或 Ultraculture 培养基中则不然。然而，由于细胞形态的变化，在 Opti-MEM 或 Ultraculture 中培养的 MRC-5 细胞在 8% FBS 下无法持续减少（图 2B）。在 VP-SFM 或 Opti-MEM 中培养的 FRhk-4 细胞显示出与在常规培养基中培养期间相似的生长速率（图 2D）。

总之，在没有 FBS 的情况下，Vero 细胞的适宜培养条件可能不适用于其他疫苗株生产细胞，例如 MRC-5 细胞。

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